Babür, hanlığını cesurca savunmasının da vermiş olduğu şevkle, genişleme politikasında önemli bir yer tutan Semerkant’ı fethetme ümidiyle hazırlıklara koyulmuştur. Semerkant padişahına karşı filizlenen iç isyanların da kuşkusuz bu arzusunda payı olmuştur. 1496 yılında Semerkant’ı kuşatan Babür ordusu güçlü bir müdafaayla karşılaşmış, burayı elde edemeden geri dönmüştür.

Uzun süren asker sevkiyatı ve uğraşlar sonucu, 1497 yılında bu kez Buhara ve Hisar padişahları Sultan Ali ve Mesut Mirza’dan da yardım alarak, Semerkant üzerine sefer düzenleyen Babür, Baysungur Mirza’nın şehrini terk etmesi sonucu çok geçmeden yönetimi ele geçirmiştir. 14 yaşında dönemin en önemli şehirlerinden birini harple fetheden Babür, burada güçlü bir yönetim oluşturma çabasına girişmiştir.

Ancak işler istediği gibi gitmemiş, aksine, genişleme politikası elindeki bölgeleri de kaybetmesiyle sonuçlanmıştır. Uzun süren savaşlar sürecinde oldukça tahrip olan Semerkant’taki ekonomik çöküş, Babür’ün şehri ele geçirmesinden sonra had safhaya ulaşmıştır. Bölgede baş gösteren kıtlık nedeniyle –Endican’da bulunan beylerin de teşvikiyle- Babür’ün ordusundaki önemli komutanlar ve askerler isyan ederek, burayı terk etmiş ve Fergana’ya dönmüşlerdir. Babür, ordusundaki askerlerin bir kısmını kaybetmesinin vermiş olduğu güçsüzlüğün üzerine hastalanmış ve oldukça sefil bir hale düşmüştür.